Western Blot（蛋白質印跡法）的步驟與應用

蛋白質印跡法（Western Blot）是一項用於檢測特定蛋白質的實驗技術，由美國科學家喬治·斯塔克（George Stark）發明。該方法依賴電泳技術將蛋白質分離，轉移至固相膜（如NC或PVDF），然後以抗體進行標記與檢測。因其能精確識別疾病相關抗原，目前已廣泛應用於生物醫學研究與診斷領域。以下將介紹其原理、分類、樣品處理及操作步驟。

一、原理

Western Blot 類似 Southern Blot 或 Northern Blot，但具以下特點：

• 使用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白質
• 目標為蛋白質，而非核酸
• 探針為抗體，而非核酸序列
• 以標記的二抗（如 HRP 或 AP）進行顯色或發光檢測

實驗流程包括：電泳分離 → 轉膜 → 封閉 → 一抗孵育 → 二抗孵育 → 顯色/發光檢測。通過此流程，可保持蛋白質的分子大小與生物活性的完整性。

二、分類與顯色方法

Western Blot 根據顯色機制可分為以下幾類：

1. 放射自顯影（Autoradiography）

使用放射性標記的二抗，適合高靈敏度需求。

2. 底物化學發光（ECL）

目前最常用的方法之一。二抗標記為 HRP，與發光底物（如魯米諾及過氧化物）作用後，產生強光信號，適合膠片曝光與圖像分析。

3. 底物熒光（ECF）

以熒光為信號輸出方式，適合多通道檢測。

4. 底物DAB呈色

依賴辣根過氧化物酶（HRP）催化 DAB 顯色，呈現褐色沉積，常用於永久切片標記。

實務上，ECL 與 DAB 為最常見的兩種方法。實驗設計時需根據檢測目的、設備條件與標本特性選擇適當的顯色方式。

三、樣品制備

良好的樣品品質是獲得可靠結果的關鍵，常見樣品來源包括：

1. 單層貼壁細胞總蛋白提取

適用於培養的哺乳動物細胞，需使用適畦的裂解緩衝液與蛋白酶抑制劑。

2. 組織中總蛋白提取

取新鮮或冷凍組織，進行均質化與離心，獲取上清液中的可溶性蛋白。

3. 藥物處理細胞樣品提取

用於研究藥物對蛋白表達的影響，建議在處理後迅速收集細胞，減少蛋白降解。

四、應用興展

Western Blot 不僅用於確認基因表達水平，還能：

• 檢測蛋白質的分子量與純度
• 定量分析蛋白表達量（配合內參校正）
• 研究蛋白質的修飾狀態（如磷酸化、乙酰化）
• 篩選與疾病相關的生物標記分子

儘管技術持續發展（如出現更快速的轉膜與多重檢測系統），其核心原則依舊是電泳分離 + 抗體識別。相關擴展技術包括 Southern Blot（核酸檢測）與 Northern Blot（RNA 分析），它們共同構成分子生物學實驗的重要工具套件。